KROMATOGRAFI

Nama kelompok:

1.Laela Nurul Rahma                     (A.102.08.037)

2.Leonado Bagus Utomo               (A.102.08.038)

3.Nia Lestyowati                               (A.102.08.043)

4.Nina Novita R.S                            (A.102.08.044)

Kelas:1B2

“Kromatografi merupakan suatu proses pemisahan yang mana analit-analit dalam sampel terdistribusi antara 2 fase, yaitu fase diam dan fase gerak.”

Dari pengertian di atas dapat diketahui kalo ada dua komponen penting dalam kromatografi yaitu fase diam dan fase gerak. Dan perlu dicatat bahwa hasil pemisahan kromatografi yang baik bukan lagi berbentuk senyawa melainkan berbentuk tunggal.

Fase diam (Stationary phase)

Fase diam merupakan salah satu komponen yang penting dalam proses pemisahan dengan kromatografi. kenapa? karena dengan adanya interaksi dengan fase diamlah terjadi perbedaan waktu retensi (tR) dan terpisahnya komponen senyawa analit.

Fase diam dapat berupa bahan padat atau porous (berpori) berbentuk molekul kecil atau cairan yang umumnya dilapiskan pada padatan pendukung.

Fase gerak (Mobile phase)

Fase gerak merupakan pembawa analit dapat bersifat inert maupun berinteraksi dengan analit tersebut. Nah fase gerak ini g melulu hanya cairan. Tapi juga dapat berupa gas inert yang umumnya dapat dipakai sebagai carrier gas senyawa mudah menguap (volatil)

Pemisahan dengan kromatografi

Pemisahan dengan kromatografi sendiri lebih baik daripada ekstraksi. kenapa? Karena sering diibaratkan dengan corong pisah yang saling berhubungan yang bergerak dari atas ke bawah dimana pada setiap corong pisah terjadi pemisahan. Selain itu permukaan antar fase pada kromatografi lebih besar.

Lalu apa yang menyebabkan senyawa tersebut dapat dipisahkan?

Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya kalo pemisahan senyawa-senyawa dapat diamati dengan perbedaan waktu retensi (tR) pada kromatogram.

“Waktu retensi (tR) adalah waktu yang diperlukan oleh analit dari awal kolom sampai ke detektor”

Semakin lama analit berinteraksi dengan fase diam –> semakin lama ia keluar –> tR semakin besar

Sehingga ada suatu konstanta yang menyatakan kecepatan migrasi solut melalui fase diam. Kecepatan migrasi solut dipengarui oleh perbandingan distribusinya (Kd atau kadang disebut D) yang ditentukan oleh afinitas relatif solut pada fase diam dibanding fase gerak:

Kd = Kadar senyawa dalam fase diam/Kadar senyawa dalam fase gerak

Dari persamaan tersebut dapat ditarik kesimpulan kalo semakin besar harga Kd suatu senyawa maka waktu retensinya (tR) akan semakin besar karena interaksi dengan fase diam besar dan migrasinya semakin lambat.

Parameter kinetika pemisahan

Faktor Selektifitas (α)

“Selektifitas merupakan kemampuan instrumen dalam mengenali senyawa-senyawa dalam campuran”

untuk mendapat selektifitas yang maksimum maka harus dicari interaksi yang sesuai (apakah partisi, adsorpsi, size exclusion, atau ion exchange). Faktor selektifitas (α) dapat dicari dengan:

α = k2/k1 = (tR2-tm)/(tR1-tm)

Apabila kedua senyawa memiliki nilai K yang sama / α = 1 maka kedua senyawa tidak dapat dipisahkan. karena waktu retensinya identik.

Faktor Spesifisitas (Kd)

Sifat spesifisitas dari kromatografi didasarkan pada sifat dari senyawa yang spesifik. Senyawa memiliki sifat spesifik karena memiliki Kd yang spesifik.

Kapasitas Kolom (K’)

Menunjukkan kemampuan kolom menampung analit. Semakin lama analit berada dalam kolom, akan semakinb esar nilai kapasitasnya. Nilai K’ yang bagus antara 1-10. Jika k’ terlalu kecil, kemungkinan pemisahannya belum sempurna dan jika terlalu besar maka akan terjadi pelebaran puncak.

Resolusi (Rs)

Untuk taraf kepercayaan 95%, harga Rs yang baik adalah > 1,5. Jika kurang dari ini maka puncak dari masing2 analit akan saling tumpang tindih

Jumlah Lempeng Teoritis (Neff)

Merupakan parameter yang menghitung efisiensi kromatografi. Menyatakan jumlah peristiwa partisi yang dialami oleh analit pada setiap saat yang dibawa oleh fase gerak selama elusi.

Interaksi Analit dan Fase diam

Setelah tahu tentang konsep pemisahan nyambung kesini. Sebenarnya secara sederhana mekanisme pemisahan analit dibedakan menjadi 4, hal ini yang mengakibatkan perbedaan waktu retensi karena perbedaan interaksi analit dengan fase diamnya.

1. Adsorbsi

Fase diam: Padatan

Fase gerak: Cair (bisa juga gas pada Kromatografi padat-gas)

Dasar pemisahan: Stereokimia

2. Partisi

Fase diam: Cair

Fase gerak: Cair atau gas (pada kromatografi cair-gas)

Dasar pemisahan: Partisi-konsep like dissolves like

Untuk kromatografi jenis ini dasarnya adalah senyawa yang memiliki kemiripan sifat fisika kimia dengan fase diam akan tertambat lebih lama pada fase diam –> tR lebih besar

Sebagai contoh jika kita ingin memisahkan kafein dan parasetamol pada sampel obat flu (kaya praktikum HPLC hehe) dengan fase diam ODS (Oktadesil silika) yang nonpolar. maka parasetamol akan lebih dulu keluar dari kolom atau tR lebih kecil daripada kafein. karena Kafein sifatnya nonpolar dan lebih terlarut pada fase diam. sedangkan parasetamol bisa terlarut dikit tp cuma sebentar.

3.  Penukar ion (bahasa kerennya: ion exchange)

mekanisme pemisahan karena interaksi ionik antara fase diam dan solut. biasanya dipake di pabrik farmasi untuk bikin air bebas ion (sori lupa namanya haha). berdasarkan muatan yang dilapiskan pada fase diam, dapat dibagi 2:

a. Penukar anion: Fase diamnya muatan positif sehingga yang bermuatan negatif akan ketarik fase diam

b. Penukar kation: Fase diamnya bermuatan negatif sehingga yang bermuatan positif akan ketarik fase diam

4. Ekslusi ukuran (bahasa kerennya: Size Exclusion Chromatography)

Prinsip kerjanya pemisahan analit berdasarkan ukuran. Biasanya pake fase diam dengan pori berukuran tertentu.

Jadi ntar saat elusi, molekul yang kecil akan masuk ke pori fase diam. semakin kecil maka dapat masuk semakin dalam. sedangkan molekul yg besar dia g bisa masuk ke pori sehingga langsung terelusi.

Kesimpulannya: Partikel dengan ukuran besar (BM besar) memiliki tR lebih kecil daripada partikel dengan ukuran kecil (BM kecil)

TUGAS INSTRUMENTASI XI

ELISA ( ENZYM LINKED IMMUNOSORBENT  ASSAY)

Nama kelompok:

1.Laela Nurul Rahma                     (A.102.08.037)

2.Leonado Bagus Utomo               (A.102.08.038)

3.Nia Lestyowati                               (A.102.08.043)

4.Nina Novita R.S                            (A.102.08.044)

Kelas:1B2

    Sejarah ELISA

Sebelum pengembangan ELISA, satu-satunya pilihan untuk melakukan suatu immunoassayadalah radioimmunoassay, teknik menggunakan antigen berlabel radioaktif atau antibodi. Dalamradioimmunoassay, radioaktivitas memberikan sinyal, yang menunjukkan apakah suatu antigen tertentuatau antibodi hadir dalam sampel. Radioimmunoassay pertama kali dijelaskan dalam kertas olehRosalyn Sussman Yalow dan Salomo Berson diterbitkan pada tahun 1960. Sebuah mikrobiologimenggunakan enzim suatu Linked tes Assay (ELISA) immunosorbent, dalam rangka untuk mengembangkan metode untuk deteksi cepat antigen p24 HIV dalam sampel darah.

Karena radioaktivitas menimbulkan ancaman kesehatan potensial, alternatif yang lebih aman itu dicari. Sebuah alternatif yang cocok untuk radioimmunoassay akan mengganti sinyal non-radioaktif di tempat sinyal radioaktif. Ketika enzim (seperti peroksidase) bereaksi dengan substrat yang sesuai(seperti ABTS atau 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine), perubahan warna terjadi, yang digunakan sebagai sinyal. Namun, sinyal tersebut harus dikaitkan dengan keberadaan antibodi atau antigen, yang mengapaenzim harus dihubungkan dengan antibodi yang sesuai. Proses menghubungkan secara independendikembangkan oleh Stratis Avrameas dan GB Pierce. Karena itu perlu untuk menghilangkan antibodiatau antigen terikat dengan mencuci, antibodi atau antigen harus tetap ke permukaan wadah;. Yaitu,immunosorbent telah harus dipersiapkan. Sebuah teknik untuk mencapai hal ini diterbitkan oleh Wide dan Jerker Porath pada tahun 1966. 

Pada tahun 1971, Petrus Perlmann dan Eva Engvall di Universitas Stockholm di Swedia, dan Anton Schuurs dan Bauke van Weemen di Belanda mandiri makalah yang disintesis pengetahuan ini ke dalam metode untuk melakukan EIA / ELISA.

  Pengertian ELISA

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Dalam pengertian sederhana, sejumlah antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik dicucikan pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi, saat cahaya dengan panjang gelombang  tertentu disinarkan pada suatu sampel, kompleks antigen/antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya fluoresensi.

Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk antigen tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada suatu permukaan solid (biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene), baik yang non-spesifik (melalui penyerapan pada permukaan) atau spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain yang  spesifik untuk antigen yang sama, disebut ‘sandwich’ ELISA). Setelah antigen diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks dengan antigen. Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan enzim, atau dapat dideteksi  secara langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim melalui biokonjugasi. Di antara tiap tahap, plate harus dicuci dengan larutan deterjen lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodi yang tidak terikat. Setelah tahap pencucian terakhir, dalamplate ditambahkan substrat enzimatik untuk memproduksi sinyal yang visibel, yang menunjukkan  kuantitas antigen dalam sampel. Teknik ELISA yang lama menggunakan substrat kromogenik, meskipun metode-metode terbaru mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh lebih sensitif.

Aplikasi ELISA

ELISA dapat mengevaluasi kehadiran antigen dan antibodi dalam suatu sampel, karenanya merupakan metode yang sangat berguna untuk mendeterminasi konsentrasi  antibodi  dalam serum (seperti dalam tes HIV), dan juga untuk mendeteksi kehadiran antigen. Metode ini juga bisa diaplikasikan dalam industri makanan untuk mendeteksi allergen potensial dalam makanan seperti susu, kacang, walnut, almond, dan telur. ELISA  juga dapat digunakan dalam bidang toksikologi untuk uji pendugaan cepat pada berbagai kelas obat.

ELISA adalah tes skrining dahulu banyak digunakan untuk HIV karena kepekaan tinggi. Dalam ELISA, serum seseorang diencerkan 400 kali lipat dan diterapkan pada pelat yang antigen HIV yang terpasang. Jika antibodi terhadap HIV hadir dalam serum, mereka dapat mengikat antigen HIV. Pelat ini kemudian dicuci untuk menghapus semua komponen lain dari serum. Sebuah "antibodi sekunder" khusus disiapkan - antibodi yang mengikat antibodi lain - kemudian diterapkan ke piring, mencuci diikuti oleh yang lain. Ini antibodi sekunder secara kimiawi terkait di muka untuk enzim.
"Anti IgG manusia" Antibodi Ganda Sandwich ELISA

Dengan demikian, piring akan berisi enzim sebanding dengan jumlah antibodi sekunder terikat ke piring. Sebuah substrat untuk enzim diterapkan, dan katalisis oleh enzim mengarah ke perubahan pada warna atau fluoresensi. Hasil ELISA dilaporkan sebagai nomor; aspek paling kontroversial dari tes ini adalah menentukan "cut-off" titik antara positif dan hasil negatif. Sebuah titik cut-off dapat ditentukan dengan membandingkannya dengan standar yang dikenal. Jika tes ELISA digunakan untuk skrining obat di tempat kerja, konsentrasi cut-off, 50 ng / mL, misalnya, didirikan, dan sampel yang berisi konsentrasi analit standar akan disiapkan. Diketahui bahwa menghasilkan sinyal yang lebih kuat daripada sampel dikenal adalah "positif." Mereka yang menghasilkan sinyal lemah, yang "negatif."Dokter Dennis E Bidwell dan Alister Voller menciptakan tes.

Kegunaan lain dari ELISA meliputi:

1. deteksi antibodi mikobakteri dalam TB.

2. deteksi rotavirus dalam tinja.

3. deteksi penanda hepatitis B dalam serum.

4. deteksi enterotoksin E. coli dalam tinja.

  Tipe-tipe ELISA

Ada beberapa tipe-tipe ELISA, diantaranya adalah sebagai berikut:

1.      Indirect ELISA

2.      Sandwich ELISA

3.      Competitive ELISA

Prinsip metode ELISA

mereaksikan antibodi dan antigen secara spesifik, perbedaannya ada pada substrat ( zat yang digunakan untuk mendeteksi suatu hasil reaksi ) yang digunakan. Pada ELISA, hasil reaksi akan memunculkan warna yang bisa diukur dengan alat yang disebut Colorimetri. Pada Fluorescence, hasil reaksi berupa pendaran cahaya yang terbaca oleh fluoresensi, sedangkan pada Chemiluminescence hasil reaksi berupa pendaran kimiawi yang terbaca oleh Chemiluminescent.

 

Jenis Pemeriksaan ELISA

Langkah-langkah "tidak langsung" ELISA mengikuti mekanisme di bawah ini: -

• Sebuah solusi buffer dari antigen yang akan diuji untuk ditambahkan ke setiap sumur dari lempeng mikro , di mana ia diberi waktu untuk mematuhi plastik melalui interaksi biaya.
• Sebuah solusi non-protein bereaksi, seperti bovine serum albumin atau kasein , ditambahkan untuk memblokir setiap permukaan plastik di sumur yang masih dilapisi oleh antigen.
• Selanjutnya antibodi primer ditambahkan, yang mengikat secara khusus terhadap antigen lapisan tes yang baik. Antibodi primer ini juga bisa dalam serum donor akan diuji untuk reaktivitas terhadap antigen.
• Setelah itu, sebuah antibodi sekunder yang ditambahkan, yang akan mengikat antibodi primer.. Antibodi sekunder ini sering memiliki enzim yang melekat padanya, yang memiliki efek yang dapat diabaikan pada sifat pengikatan antibodi.
• Sebuah substrat untuk enzim ini kemudian ditambahkan. Seringkali, perubahan warna substrat ini pada reaksi dengan enzim.  Perubahan warna menunjukkan bahwa antibodi sekunder telah terikat antibodi primer, yang sangat menyiratkan bahwa donor memiliki reaksi kekebalan terhadap antigen uji. Hal ini dapat membantu dalam pengaturan klinis, dan dalam R & D.
• Semakin tinggi konsentrasi antibodi primer yang hadir dalam serum, semakin kuat perubahan warna. Seringkali spektrometer digunakan untuk memberikan nilai kuantitatif untuk kekuatan warna.

Enzim bertindak sebagai penguat, bahkan jika hanya sedikit enzyme-linked tetap terikat antibodi, molekul enzim akan menghasilkan banyak molekul sinyal. Dalam keterbatasan akal sehat, enzim dapat terus menghasilkan warna tanpa batas waktu, tetapi yang lebih utama antibodi hadir dalam serum antibodi donor lebih sekunder + enzim akan mengikat, dan warna lebih cepat akan berkembang..Kelemahan utama dari ELISA tidak langsung adalah bahwa metode imobilisasi antigen non-spesifik, ketika serum digunakan sebagai sumber antigen tes, semua protein dalam sampel bisa tetap berpegang pada pelat mikro dengan baik, konsentrasi begitu kecil analit dalam serum harus bersaing dengan protein serum lainnya ketika mengikat ke permukaan baik. Sandwich atau langsung ELISA memberikan solusi untuk masalah ini, dengan menggunakan "menangkap" antibodi spesifik untuk antigen tes untuk menariknya keluar dari campuran molekul serum itu.

ELISA dapat dijalankan dalam format kualitatif atau kuantitatif. Hasil kualitatif memberikan hasil positif atau negatif sederhana (ya atau tidak) untuk sampel. Cutoff antara positif dan negatif ditentukan oleh analis dan mungkin statistik.  Dua atau tiga kali standar deviasi (kesalahan yang melekat dalam tes) sering digunakan untuk membedakan positif dari sampel negatif.  Dalam kuantitatif ELISA, densitas optik (OD) dari sampel dibandingkan dengan kurva standar, yang biasanya pengenceran serial solusi dikenal-konsentrasi dari molekul target. Sebagai contoh, jika sebuah sampel uji mengembalikan OD 1,0, titik pada kurva standar yang memberi OD = 1,0 harus dari konsentrasi analit yang sama sebagai sampel Anda.

Gambar untuk hak tersebut termasuk penggunaan antibodi sekunder terkonjugasi untuk enzim, meskipun, dalam arti teknis, hal ini tidak diperlukan jika antibodi primer adalah konjugasi enzim. Namun, penggunaan konjugasi antibodi sekunder-menghindari proses yang mahal untuk menciptakan enzim-linked antibodi untuk setiap antigen yang satu mungkin ingin mendeteksi. Dengan menggunakan antibodi enzyme-linked yang mengikat wilayah Fc dari antibodi lain, antibodi ini enzyme-linked yang sama dapat digunakan dalam berbagai situasi. Tanpa lapisan pertama antibodi "menangkap", setiap protein dalam sampel (termasuk protein serum) dapat menyerap kompetitif ke permukaan piring, menurunkan jumlah antigen amobil. Penggunaan antibodi spesifik dimurnikan untuk melampirkan antigen ke plastik menghilangkan kebutuhan untuk memurnikan antigen dari campuran yang rumit sebelum pengukuran, menyederhanakan uji, dan meningkatkan spesifisitas dan sensitivitas pengujian tersebut.

sumber : 1. http://pandalikespurple.blogspot.com/2012/04/test-elisa.html